光遗传技术

光遗传学（optogenetics）是结合了光学（optics）及遗传学（genetics）的技术，能在活体动物甚至是自由运动的动物脑内，精准地控制特定种类神经元的活动。光遗传学在时间上的精确度可达到毫秒级别，在空间上的精确度则能达到单个细胞级别。2010年，光遗传学被Nature Methods选为年度方法，同年被Science认为是近十年来的突破之一。这项技术目前在神经科学领域应用非常广泛，未来可能会应用于多种神经和精神疾病的治疗，如帕金森氏病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、精神分裂症等。

图1.光遗传学技术

光遗传学之前

1979年诺贝尔奖得主弗朗西斯·克里克首次提出，为了了解大脑如何运作，我们需要一种方法，可以每次只让某一特定型态神经元活动被抑制，而不影响其他神经元的活动。在光遗传学技术之前，人们通常采用电刺激来进行神经科学的相关研究，即将电极埋入动物脑内，然后用电刺激激活神经元，但是其最大的缺点是对于神经元的操作没有特异性，而且无法进行精确定位，因此所得出的研究结果往往缺乏特异性，另外，用电刺激只能激活神经元，而无法抑制神经元的活动。

随着基因工程技术的发展，科学家开始利用化学药物联合转基因技术来精确定位特定的神经元并进行相关研究，尽管解决了特异性问题，但是化学刺激的方法在时间上的精确度缺乏保证。

因此神经科学家们急切需要一种能以非常高的时间精确度、特异性地激活或者抑制特定种类神经元活动的方法。

光遗传学的发展历程

早在1973年，微生物学家便发现细菌视紫质（Bacteriorhodosin）光照之后会成为离子转运蛋白，1977年发现盐细菌视紫红质（Halorhodopsin，NpHR）也是离子转运蛋白，照黄绿光后会将氯离子打出细胞，2002年发现光敏感通道（Channelrhodopsins），蓝光照射之后会将阳离子打进细胞。

2005年9月份，斯坦福大学的Karl Deisseroth实验室在nature neuroscience上发表了一篇Technical Report，第一次将Channelrhodopsin-2（ChR2）表达在神经元里，发现可以用蓝光精确地控制神经元的活动（图2），而光遗传学（optogenetics）一词也随之出现。随后发现Bacteriorhodosin与Halorhodopsin也都能在神经元表达，准确调控神经元的活动，并不会对神经元产生毒害作用。此后，光遗传学迅速改变神经科学界，成为研究特定神经元在大脑中扮演何种角色不可或缺的工具。

图2.将ChR2表达在神经元膜上，然后用470nm蓝色激光进行照射

光遗传学的基本原理

当神经元处于静息状态时，细胞膜两边存在着电位差，这就是静息电位。静息电位的产生是由于膜内外各种离子的分布不均衡，以及细胞膜在不同情况下，对各种离子的通透性不同造成的。在静息状态下，细胞膜对K+有较高的通透性，且膜内K+又高于膜外，K+顺着浓度差向膜外扩散；细胞膜对阴离子（A-）无通透性，膜内大分子A-被阻止在膜的内侧，从而形成膜内为负、膜外为正的电位差，这种电位差产生后，可阻止K+进一步向外扩散，使膜内外电位差达到一个稳定的数值，即静息膜电位（resting membrane potential）。当神经元受到刺激而兴奋时，在静息电位的基础上，发生一次扩布性的电位变化，称为动作电位（action potential）。动作电位是一个连续的膜电位变化过程，细胞膜受刺激而兴奋时，膜上Na+通道迅速开放，由于膜外Na+浓度高于膜内，电位比膜内正，所以，Na+顺浓度差和电位差内流，使膜内的负电位迅速消失，并进而转为正电位。这种膜内为正、膜外为负的电位梯度，阻止Na+继续内流。当促使Na+内流的浓度梯度与阻止Na+内流的电位梯度相等时，Na+内流停止，即达到了动作电位的峰值。因此，动作电位的产生和Na+内流息息相关。

光遗传技术的基本原理如图所示（图3）。首先，给神经元转入膜通道蛋白，如ChR2或NpHR。对于ChR2来说，当有473nm的蓝色激光照射时，这些通道蛋白的通道打开，允许阳离子（如Na+）大量内流，产生动作电位，即让神经元处于兴奋状态。对于NpHR来说，当有580nm的黄色激光照射时，这些通道蛋白的通道打开，允许Cl-通过，使神经元一直处于静息电位，即让神经元保持静息状态。

图3.光遗传学的基本原理（以ChR2和NpHR为例）

光遗传学技术的研究步骤

光遗传学技术的应用主要包括以下几个关键步骤（图4）：

1.  需要寻找合适的光敏蛋白：例如起兴奋神经元作用的Channelrhodopsin-2（ChR2），起抑制神经元作用的Halorhodopsin（NpHR）和Archaerhodopsin（Arch）等，这类蛋白质具有天然的光敏性，或经过修饰后具有光敏性；

2.  将遗传信息传递给靶细胞：一般通过病毒转导、转染、转基因动物等方式将光敏蛋白的遗传信息传递给靶细胞；

3.  可控性演示：即通过导入光纤、控制激光来实现对神经元活动的精确控制；

4.  实验方法的有效性验证：一般采用电极记录神经元细胞膜内外电压变化，以此来验证光遗传的有效性；

5.  表型检测：通过行为学测试来评估神经元活动对动物行为的影响。

图4.光遗传学实验基本步骤（以ChR2为例）

几种激活神经元的通道蛋白

1.  ChR2(H134R)：ChR2的突变体，将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，该蛋白质可以产生两倍的光电流，但通道开关速度也比野生的ChR2慢了一倍；

2.  ChR2(C128S/D156A): ChR2的突变体，超灵敏光敏感通道，用蓝色激光打开通道，然后用绿色或黄色激光关闭通道，可以打开其离子通道长达30分钟；

3.  ChR2(E123T/T159C): ChR2的突变体，更大的光电流和更快的动力学变化；

4.  ChETA：ChR2的突变体，使得神经元在激光刺激下可以发放200Hz的spike，而其他的ChR2 通道蛋白只能达到40Hz；

5.  C1V1：由ChR1及由团藻发现的VChR1组合在一起的通道蛋白，在红色激光刺激下打开通道。

几种抑制神经元活动的通道蛋白

1.  NpHR：即为Halorhodopsin，第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，而抑制神经元活动。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，会聚集在内质网上，而如果将内质网输出元件加在NpHR基因序列后面，这样可以使得NpHR在胞内高量表达，而且不会聚集在内质网上，这样修改过的NpHR被称为eNpHR2.0。但是eNpHR2.0在细胞膜的聚集仍然不够，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量聚集，这样修改过的NpHR被称为eNpHR3.0；

2.  Arch：即为archaerhodopsin，是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元处于超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。在特定条件下，可用于增加细胞内pH或减少细胞外基质pH。和NpHR相比，当激光关闭的时候，Arch立即从通道打开状态恢复到关闭状态。

3.  Mac:即为 Leptosphaeria maculans fungal opsins，蓝色激光激活的质子泵，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元保持超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。

结语

光遗传技术具有独特的高时空分辨率和细胞类型特异性两大特点，克服了传统手段控制细胞或有机体活动的许多缺点，能对神经元进行非侵入式的精准定位刺激操作而彻底改变了神经科学领域的研究状况，为神经科学提供了革命性的研究手段。光遗传技术在将来还有可能发展出一系列针对中枢神经系统疾病的新疗法。